آزمایشگاه موزبائر آزمایشگاه DLS آزمایشگاه شیمی آزمایشگاه X-Ray آزمایشگاه میکروسکوپی
یکشنبه ۳۱ فروردین
 
مروری بر آماده سازی نمونه‌های نوکلئوپروتئین و دی ان ای برای AFM

مروری بر آماده سازی نمونه‌های نوکلئوپروتئین و دی ان ای برای AFM
١٩  دی , ١٣٨٩

میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) در سال 1986 اختراع شد و سپس برای استفاده در بخش‌های مختلف از جمله مواد زیستی توسعه داده شد. طرح شماتیک این میکروسکوپ در شکل 1 آمده است. بخش مثلثی آبی رنگ نوک میکروسکوپ بوده که وظیفه آن اسکن سطح ( که به صورت پستی بلندی‌های سبزرنگ در تصویر آمده) است. بخش نوک به تیرک (کانتالیور) متصل بوده که با نوسانات روی سطح پروفایلی از سطح ایجاد می‌کند.

 

 

 برای ره‌گیری نوسانات نوک، از نور لیزر استفاده می‌شود به شکلی که نور به نوک برخورد کرده و روی یک شناساگر  نوری منعکس می‌شود. نکات مهمی در طراحی میکروسکوپ AFM وجود دارد که در ذیل به برخی از آنها اشاره می‌شود. اولین نکته مهم آن است که موقعیت نمونه و نوک باید دائما با دقت 1 نانومتر کنترل شود. همچنین نوک باید به صورت اتمی تیز باشد. در نهایت تغییرات نوک نسبت به سطح نمونه باید با دقتی کمتر از یک نانومتر ثبت گردد. با رعایت این موارد می‌توان تصویری با دقت اتمی از سطح ایجاد کرد.

 

 

مدهای تصویربرداری AFM:

تصویر 2 مدهای اصلی تصویربرداری AFM را نشان می‌دهد بخش مربوط به جاذبه میان نوک و سطح نمونه بخش مد غیرتماسی (NC) است. بعد از عبور از مینیموم در این نمودار، نیروی دافعه میان نوک و سطح نمونه بوجود می‌آید که این بخش مربوط به مد تماسی است. از آنجایی که تماس نوک با سطح بسیار شدید است این کار می‌تواند منجر به تغییرشکل نمونه شود حتی می‌تواند موجب جهیدن اتم از نوک به سطح یا برعکس شود. بنابراین مد تماسی برای گرفتن تصاویر با رزولشن اتمی مناسب نیست. همچنین برای نمونه‌های زیستی که بسیار حساس‌اند مد تماسی موجب تغییر شکل آنها شود. برای نمونه‌های زیستی مد متناوب (IC) مناسب می‌باشد. این مد که نام‌های متعددی نظیر TM وAC دارد به شکلی است که در آن نوک میکروسکوپ به صورت متناوب به سطح برخورد می‌کند. در واقع نوک با فرکانسی نزدیک به فرکانس تشدید خود نوسان می‌کند دامنه این نوسان نیز بسیار کوچک است. با نزدیک شدن نوک به سطح به دلیل وجود نیروی جاذبه واندروالسی فاز نوسان و دامنه آن تغییر می‌کند این تغییر توسط یک سیستم بازخوردی[1] رصد شده و با کمک آن فاصله میان نوک و سطح نمونه در حد مشخصی تنظیم می‌شود. با توجه به این که در این مد می‌توان به آرامی سطح مواد زیستی را اسکن کرد این روش برای تصویربرداری از مواد زیستی بسیار جذاب است به طوری که تصاویری که با کمک AFM از سطح DNAها گرفته می‌شود به کارا است که میکروسکوپ الکترونی قادر به گرفتن چنین تصاویری نیست.

فاکتورهای موثر در رزولشن AFM

مهمترین فاکتوردر رسیدن به رزولشن بالا در تصویربرداری با AFM داشتن نوک بسیار تیز است تا بتواند در مد غیرتماسی سطح را با دقت زیر یک نانومتر اسکن کند.

یکی از عوامل مشکل ساز برای رسیدن به رزولشن بالا  حرکت مولکول‌ها در اثر گرما است. گرفتن تصویر یک پروتئین با رزولشن مولکولی به دلیل وجود حرکت در ساختار پروتئین امکان پذیر نیست بنابراین باید از سیستم‌های کرایو برای این کار استفاده کرد. در واقع سیستم‌های کرایو با سرد کردن نمونه امکان تصویربرداری با رزولشن مولکولی را فراهم می‌کند.

اثر ستونی از دیگر عوامل محدود کننده در AFM است. وقتی سطحی در معرض هوا قرار می‌گیرد مولکول‌های آب را از هوا جذب کرده و یک لایه آب روی آن تشکیل می‌دهد. میکا یکی از موادی است که به صورت سنتی در تصویربرداری AFM استفاده می‌شود این ماده آبدوست بوده و در خلاء از سطح آن زدوده می‌شود. از سوی دیگر جنس نوک سیلیکون است که این ماده نیز آبدوست می‌باشد. بنابراین با نزدیک شدن نوک به سطح یک پل از جنس آب میان نوک و سطح ایجاد می‌شود به آن اثر ستونی گفته می‌شود. این نیرو می‌تواند نمونه را روی سطح حرکت دهد که در نهایت منجر به خراب شدن تصویر شود. برای رهایی از این مشکل باید تصویربرداری در رطوبت بسیار پایین انجام شود تا اثر ستونی به حداقل خود برسد. از انجایی که بیشتر مواد زیستی آبدوست هستند برای فائق شدن به این مشکل در نمونه‌های زیستی، نوک میکروسکوپ بصورت نوسانی روی نمونه بالا و پایین می‌رود. البته همانطور که گفته شد خلاء می‌توان آب را از محیط خارج کرده و اثر ستونی را کاهش دهد به همین دلیل در سیستم‌های AFM وSTM با بزرگنمایی بالا از خلاء استفاده می‌شود اما برای نمونه‌های زیستی خلاء خیلی مناسب نیست. از سویی در محیط‌های آبی اثر ستونی وجود ندارد و محیط‌های آبی برای نمونه‌های زیستی بسیار محیط‌ها خوبی است. بنابراین تصویربرداری در محیط‌های آبی برای مواد زیستی بسیار ایده‌آل است.

روش‌های آماده سازی نمونه برای تصویربرداری از اسیدهای نوکلئیک:

 اولین بار برای تصویربرداری از یک رشته DNA آن را روی ورقه میکا قرار داده و پیش از آن را با محلول حاوی یون‌های منیزیم در هم آمیختند. وظیفه یون‌های منیزم اتصال ورقه میکای دارای بار مثبت به رشته DNA دارای بار منفی است. نتیجه کار این است که رشته‌های DNA به محکمی به ورقه میکا می‌چسبد و می‌توان از آن تصویربرداری کرد. مطالعات بعدی نشان داد که از یون‌های کبالت، لانتانیوم و زیرکونیوم نیز می‌توان برای این کار استفاده کرد. البته بعدها مشخص شد که افزدون یون منیزیم به سطح میکا ضروری نیست می‌توان آن را به محلول بافر DNA اضافه کرد. این روش تنها برای DNA نبوده و برای تصویربرداری از DNA حاوی پروتئین نیز می‌توان از یون منیزیم استفاده کرد.

یکی دیگر از روش‌های آماده سازی DNA ریختن آن روی سطح میکای دارای پوشش کربنی است. علاوه براین می‌توان DNA را روی سطح حاوی دولایه کاتیونی نشاند و از آن تصویر گرفت.

بستری از فلز طلا نیز می‌تواند با خودآرایی گروه‌های تیول برای تصویربرداری از DNA مورد استفاده قرار گیرد. شیشه ساعت نیز می‌تواند به کروماتین‌ها (پروتئین‌هایی که رشته های DNA به دور آنها می‌چرخند) بچسبد البته مرحله شستشو، برای زدودن ترکیبات و مواد ناخواسته)، به آرامی صورت بگیرد و تصویربرداری بلافاصله پس از خشک کردن انجام شود. از میان روش‌های فوق، روش مربوط به بهره‌گیری از کاتیون از دیگر روشها رایج‌تر است زیرا بسیار ساده است. مشکل این روش آن است که ضرورتا باید از کاتیون‌های چند ظرفیتی استفاده شود بنابراین شرایط آزمایش محدود به بافرهایی با غلظت مشخصی از کاتیون می‌شود.

در کنار روش مبتنی بر کاتیون روش دیگر وجود دارد که در آن سطح میکا را بصورت شیمیایی توسط آلکوکسی سیلان‌های مناسب عامل‌دار می‌کنند. 3-آمینوپروپیل‌تری‌اتوکسی سیلان یکی از مواد مناسب برای اتصال به شیشه یا سیلیکا است این ماده از طریق بخش سیلان خود به شیشه چسبیده و می‌تواند گروه‌های امینو اسید را به روی سطح بیاورد. با این کار سطح عامل‌دار دارای بار مثبت شده و می‌تواند به DNA دارای بار منفی بچسبد. تصویر 3 با این روش گرفته شده است.

تصویربرداری از اشکال فوق مارپیچ DNA:

اتصال DNA به سطح موجب کج شدن و تغییر ساختار آن می‌شود که این مسئله به شدت و نوع برهمکنش میان سطح و DNA بستگی دارد. برای بررسی این برهمکنش می‌توان از ساختارفوق مارپیچ DNA استفاده کرد. این ساختار به شدت به شرایط محیطی حساس است. ساختار فوق مارپیچ بسیار متحرک بوده و متناسب با شرایط محیطی شکل می‌گیرد. زمانی که محققان از دولایه‌های لیپیدی کاتیونی به عنوان بستر برای DNA استفاده کردند تغییرات بسیار شدیدی را درپیکربندی DNAهای فوق مارپیچ مشاهده کردند. افزودن مقداری EDTA نیز مقدار درهم تنیدگی رشته ها را افزایش داد. اما اگر EDTA به همراه دولایه‌های لیپیدی به سیستم اضافه شود از شدت تنیدگی‌ها می‌کاهد. در ادامه کار محققان برای تصویربرداری از DNA دارای ساختار پلکتونمیک (رشته‌های در هم پیچیده) از سیستم یون منیزیوم استفاده کردند آنها با کمال تعجب دیدند که ساختار فوق مارپیچ در DNA دیده نمی‌شود و تعداد پیچ خوردگی‌های آن نیز به شدت کاهش یافته است. هرچند با تغییر شرایط امکان ایجاد حلقه‌هایی در ساختار DNA بوجود آمد. تصویری از یک DNA با مورفولوژی پلکتونمیک در شکل 4 آمده است که با روش اماده سازی متناوب تهیه شده است. مشخص شده است که مورفولوژی این ساختار به شرایط یونی محیط بستگی دارد.

 

 

 

 

تصویربرداری از پیکربندی‌های مختلف DNA:  

DNA دارای نوعی پیکربندی‌هایی است که بصورت مقطعی در بخشی از این رشته ایجاد می‌شوند این پیکربندی‌ها عمل برخی عملکردهای DNA هستند برخی از این پیکربندی‌ها عبارتند از پیکربندی دسته چپ Z، صلیبی شکل، مارپیچ سه‌گانه بین رشته‌ای. تشکیل چنین ساختارهایی پیش از این توسط روش‌های شیمیایی و آنزیمی مورد بررسی قرار گرفته است. اما اطلاعات دقیقی درباره این پیکربندی‌ها ارائه نشده است حتی با میکروسکوپ الکترونی نیز این ساختارها قابل بررسی دقیق نبوده‌اند. AFM ابزار مناسبی جهت بررسی این پکربندی‌ها است.

پیکربندی صلیبی شکل:

برای تصویربرداری از این ساختار، DNA را روی میکا با روش متناوب آماده سازی می‌کنند. نمونه‌‌ای از این تصویر در شکل 5 آمده است که در آن نمونه را با محلول کم نمک (بافر حاوی تریس وEDTA) روی میکا نشست دادند. بخش‌های صلیبی شکل با پیکان سفید رنگ رو تصاویر مشخص شده است. اندازه آنها 15 تا 20 نانومتر بوده  و هم خوانی مناسبی با طول پیچ‌های مورد انتظار روی رشته DNA دارد.

مارپیچ سه‌گانه بین رشته‌ای:

پیکربندی مارپیچ سه‌گانه بین رشته‌ای یا H-DNA توسط یک ماده شیمیایی به نام  هموپیورین-هموپیریدین ایجاد می‌شود. یکی از لازمه‌های تصویربرداری این پیکربندی کاهش اسیدیته محیط است. در واقع باید pH محیط DNA کاهش یافته و پس از آن تصویربرداری انجام گردد.

 تصویربرداری از کمپلکس پروتئین-DNA در طول زمان:

 

 

گروهی از محققان توانستند از کمپلکس پروتئین-DNA در طول زمان تصویربراری کنند. در ابتدا آنها از فرآیند اسمبل کمپلکس DNA-پروتئین RNA پلیمراز در فاصله زمانیهای مختلف تصویر گرفتند. سپس حرکت این پروتئین را روی رشته DNA به تصویر کشیدند. در نهایت نشان دادند که در طول فرآیند نسخه برداری از DNA ، پیش برنده‌های DNA با زاویه 300 درجه اطراف پروتئین پلیمراز را محاط کردند. با توجه به مطالب ارائه شده باید گفت که برای تصویربرداری از DNA، این رشته می‌بایستی به سطح بچسبد و از سوی دیگر برای تصویر گرفتن در طول زمان می‌بایستی DNA از سطح جدا بوده تا فرآیند حرکت پروتئین به خوبی انجام شود. در اینجا با یک تناقض روبرو هستیم که این مشکل با استفاده از یک کاتیون دو ظرفیتی حل می‌شود. حرکت نوکلئوزوم یکی از ویژگی‌های کروماتین است که موجب می‌شود DNA که اطراف هسته‌های هیستون پیچیده شده است قابل دسترس شود. با روش‌های مبتنی بر فلورسانس جدا شدن DNA از هیستون مشاهده شده است اما بسیاری از سوالات مربوط به چیدمان فضایی آن بدون پاسخ مانده بود که با استفاده از روش تصویربرداری AFM در طول زمان اطلاعات زیادی بدست آمده است. شکل 6 (فریم اول)  پیچش DNA اطراف اکتامر هیستون را نشان می‌دهد که در فریم 2 این پیچش شل شده و در فریم 3 رشته DNA کاملا از هیستون جدا شده است. برای این تصویربرداری از روش اماده سازی APS میکا استفاده شده است.

تصویربرداری از کمپلکس DNA-پروتئین با AFM سرعت بالا:

یکی از مشکلات تصویربرداری با AFM در طول زمان کندی آن است به طوری که محدوده کار در حد چند دقیقه است این درحالی است که بیشتر فرآیندها با این سرعت قابل شناسایی نیستند. بنابراین روش AFM با سرعت بالا ارائه شد که سرعت تصویربرداری در آن 1000 برابر بیشتر است. با این روش می‌توان حرکت مولکول‌های منفرد میوزین را با تفکیک پذیری 100 میلی ثانیه تصویربرداری کرد. برای مثال با این روش برخی از ویژگی‌های کروماتین را که با روش‌های رایج قابل تصویربرداری نبود را تصویربرداری کرده‌اند. همچنین حرکت پروتئین RNA پلیمراز روی رشته DNA با فاصله زمانی 50 میلی ثانیه تصویربرداری شد. شکل 7 تصاویر از حرکت پروتئین EcoRII را روی DNA نشان می‌دهد که با AFM سرعت بالا گرفته شده است.

نتیجه:

AFM روشی است که مزایای بسیاری برای تصویربرداری از DNA، کمپلکس پروتئین-DNA و لیگندهای کوچک را داراست. این روش بی‌نیاز از برچسب یا رنگ است. به دلیل بهره‌مندی از روش‌های اماده سازی، AFM قادر است تصاویر مناسبی از کمپلکس‌های خطی با تعدادی نوکلوئوپروتیئین بگیرد. علاوه بر رشته‌های خطی، می‌توان از رشته‌های فوق مارپیچ نیز تصویر گرفت. تغییرات پیکربندی این رشته‌های مارپیچی با AFM قابل بررسی است. با استفاده از روشAFM در طول زمان می‌توان حرکت صلیب‌ها و ساختار H-DNA را در DNAهای فوق مارپیچ را تصویربرداری کرد. همچنین از فرآیندهای ژنتیکی مهم نظیر رونویسی، کپی کردن و نوترکیبی از DNA نیز می‌توان تصویربرداری کرد. با AFM سرعت بالا می‌توان حرکت مولکول‌ها با سرعتی نزدیک به تصویربرداری میکروسکوپ نوری تصویر گرفت با این تفاوت که تفکیک پذیری در مقیاس نانومتری است. در حال حاضر AFM با سرعت بالا با مد نوسانی کار می‌کند بنابراین کمترین آسیب از سوی نوک روی نمونه اعمال می‌شود. نوک AFM یکی از عوامل محدود کننده در تفکیک پذیری AFM می‌باشد. اخیرا با پیشرفت‌های انجام شده نوک‌هایی ساخته شده است که چند نانومتر پهنا دارند درحالی که نوک‌های پیشیم 10 تا 2- نانومتری پهنا داشتند. با این نوک‌های جدید می‌توان به تفکیک پذیری یک نانومتری رسید. برای توسعه AFM هم در بخش دستگاهی و هم بخش نمونه سازی فضای کار بسیاری وجود دارد. در پایان می‌توان گفت که پیشرفتهای انجام شده در تصویربرداری از DNA و کمپلکس‌های آن را می‌توان به دیگرسیستم‌های بیومولکولی تعمیم داد.


 
 


9001logo
آزمایشگاه معتمد

خانهتماس با مارخدادهانقشه سایت
تمامی حقوق این پایگاه متعلق به شرکت کارآفرینی و فن آوری ایران کفا میباشد.


Pardco Dvlpd.